مقالات

نقش سیگنال های فیزیکی در رفتار سلول های شبکیه چشم

مقالات علمی

در تعیین سرنوشت سلول های شبکیه عوامل فیزیکی و شیمیایی مختلفی دخیل هستند. برای طراحی داربستهایی مناسب برای درمان دژنراسیون نورون های (Neurodegeneration) شبکیه باید به این عوامل توجه کرد و با دستکاری و تغییر آنها به مطلوب ترین حالت ممکن رسید.

مطالعات پیشین نشان داده اند که استفاده از داربست های رشته ای میتوانند؛ زندهمانی، تمایز و رشد نورون ها را تحت تأثیر قرار دهد. باید به این نکته توجه کرد که شبکیه ساختاری لایه لایه و متشکل از شش لایه سلولی متمایز است که هریک از اینها توپوگرافی رشته های داربست متفاوتی را برای انجام رفتارهای صحیح خود میطلبند.

اما با توجه به جدید بودن زمینه های تحقیقاتی بر روی مهندسی بافت شبکیه، در این مطالعه فاکتورهای فیزیکی و شیمیایی پایه و تأثیر آنها بر رفتارهای سلولی شبکیه بررسی شده است.


مناسبترین پلیمری که به عنوان داربست بافت شبکیه از آن استفاده میشود، پلیکاپرولاکتون است که حال به بررسی اثر توپوگرافی رشته های این پلیمر و همچنین نشاندن عوامل شیمیایی برای عملکردی کردن (Functionalization) سطح آن و استفاده از محیط های کشت متفاوت بر روی مورفولوژی، تمایز، آرایش و جهت مندی سلول ها خواهیم پرداخت.

مطالعات صورت گرفته
برای اِعمال و مشاهده تاثیراتی که توپوگرافی داربست بر روی رفتارهای سلولی میگذارد دو نوع داربست ساخته شد؛

توپوگرافی داربست بر روی رفتارهای سلولی

۱- داربستی با رشته های جهت دار و منظم (Aligned fibers)- (D)
2- داربستی با آرایش و قرارگیری رندوم و ناهمسو (Random fibers)- (A)


به منظور فانکشنال و عملکردی کردن سطح داربست میتوان آن را با پروتئین لمینین پوشش دهی کرد. چون این پروتئین جزو گلیکوپروتئینهای ECM و دارای گیرنده اینتگرین است میتواند چسبندگی سلول ها را بر روی سطح بهبود بخشد.


در این مطالعه از دو نوع محیط کشت برای بررسی تأثیر فاکتورهای شیمیایی مختلف در رفتار سلولهای شبکیه استفاده شده است. یکی از آنها محیط کشت پایه و عمومی سلول های عصبی است که برای رشد و زنده مانی طولانی مدت نورون های سیستم عصبی مرکزی است (قابل ذکر است که شبکیه بخشی از سیستم عصبی مرکزی است) و دیگری محیطی حاوی نوتروفینهاست که این محیط کشت، بر روی زنده مانی سلول های عقدهای و همچنین افزایش طول آکسونها تاثیرگذار است.


سلول هایی که در این آزمایش مورد بررسی قرار گرفتند Retinal post-natal cells) RPNCs) هستند که در نهایت با پیگیری بیان مارکرهای مربوط به سلول های اصلی شبکیه مانند سلول های گیرنده نور و سلول های عقدهای میزان تمایز این سلول ها را متوجه میشویم.

بررسی تمایز سلولی

بررسی تمایز سلولی

به منظور بررسی اثر شرایط مختلف بر روی میزان تمایز سلول ها ۷ روز پس از شروع آزمایشها، بیان مارکرهای ویژه سلول های اصلی شبکیه (فتورسپتورها و سلول های عقدهای) پیگیری شد. بدین منظور که برای شناسایی سلول های گیرنده نور میزان رودوپسین و سلول های عقدهای مارکر TRPV4 ارزیابی شد.

ست آپ آزمایش دارای محیط کشت full-SATO و الیاف پوشش دهی شده با لمینین هستند. در تمام آزمایش ها مارکرهای مورد نظر حضور داشتند که این نشان دهنده تمایز در این شرایط است اما در روز هفتم تغییرات در موفولوژی سلول ها مشهود است.

تغییرات در موفولوژی سلول ها

بررسی تأثیر توپوگرافی بر روی سایز، شکل و مورفولوژی

طبق آزمایشها مشخص شد که توپوگرافی رشته های داربست بر روی مورفولوژی سلولها بسیار تاثیرگذار است. در روز نخست آزمایش، مورفولوژی سلول ها به شکل کروی مشاهده شد.

با گذشت زمان به مدت ۷ روز با توجه به اینکه در چه محیطی بررسی صورت میگیرد تأثیر توپوگرافی بر روی مورفولوژی سلولها مشخص میشود. برای داربست پوشش دهی نشده و محیط کشت پایه، تغییری در موفولوژی مشاهده نمیشود اما در شرایط داربست پوشش دهی شده با لمینین و محیط کشت full-SATO با تغییر در توپوگرافی، مورفولوژی های متفاوتی از سلول ها مشاهده میشود.

اولاً به دلیل بهبود شرایط، چسبندگی و به تبع آن تمایز و افزایش طول سلول های عصبی مشاهده میشود که حال اثری که در مورفولوژی دیده میشود بدین صورت است که در داربست با رشته های جهتمند، سلولها به صورت دوقطبی در جهت الیاف آرایش یافته اند ولی در داربست دارای رشته های رندوم، مورفولوژی سلول ها چندقطبی است.

این امر در جهت دهی به آکسون های سلول های عقدهای برای ما بسیار حائز اهمیت است زیرا باید همسو باشند تا در نهایت عصب بینایی را تشکیل دهند و پیام را به مغز منتقل کنند.


افزایش طول سلول های عصبی بسیار وابسته به عوامل شیمیایی است. بدین صورت که پس از گذشت هفت روز، فقط در نمونه پوشش دهی شده با محیط کشت ویژه افزایش چشمگیری در طول نورون ها مشاهده شده است و همچنین میزان افزایش در داربست دارای رشته های جهت مند بیشتر بوده است.

زاویه جهت گیری نورون ها از عواملی است که به محیط کشت سلولی بستگی ندارد. در مورد رشته های رندوم، پوشش دهی سطح نقشی در تعیین زاویه ندارد و الگوی مشخصی را برای جهت گیری نمیتوان پیش بینی کرد اما در مورد داربست دارای رشته های جهت دار، پوششدهی نیز در تعیین زاویه نورون اثرگذار است بدین صورت که اگر پوششدهی با لمینین انجام شده باشد، سلول ها در جهت الیاف جهت گیری میکنند ولی اگر پوشش دهی نشده باشد، سلول ها عمود بر الیاف آرایش مییابند.

بررسی اثر سیگنال الکترومغناطیسی
چشم و به تبع آن شبکیه، همواره در معرض امواج الکترومغناطیس قرار دارند. باتوجه به فرآیند بینایی و اینکه ما توانایی درک طیف امواج مرئی از این دسته امواج را داریم و در واقع انرژی این محدوده از امواج الکترومغناطیس است که سبب شروع واکنش های الکتروشیمیایی در سلول های عصبی شبکیه میشود.

در مطالعه ای نظر بر آن شد که تاثیرگذاری این امواج را بر روی رفتارهای تمایزی و همچنین تکثیر سلول های شبکیه در محیط برون تنی مشاهده کرد.


برای اینکه سلولها به خوبی در معرض این امواج قرار بگیرند داربستی نانوکامپوزیتی با طراحی ویژه ای ساخته شد. در ابتدا کوپلیمری از کیتوسان/ پلیکاپرولاکتون تولید شد که نتیجه آن بهبود خواص مکانیکی، زیستی و زیستتخریبی آن نسبت به هریک از پلیمرها به صورت جداگانه است.

کیتوسان میزان آبدوستی داربست را افزایش میدهد و این امر در چسبندگی سلول ها به داربست نقش مهمی ایفا میکند. در ادامه نانوذرات فسفری SrAl2O4: Eu2+, Dy3+ با خاصیت لومینوسنس، که با پلیمر پلیاتیلنگلایکول پوشش دهی شد تا زیستسازگار شود و با نسبتهای ۱۰%، ۳۰% و ۵۰% (b، c و d) در داربست توزیع شدند.

لازم به ذکر است که این نانوذرات، امواج الکترومغناطیس در محدوده طول موج نور مرئی را جذب میکنند و بازتابی با طول موج نور سبز خواهند داشت.

از ویژگی های این نانوذرات میتوان به مدت زمان بیشتر تابش نسبت به ذرات فسفرسانس اشاره کرد. این ذرات تابشهای رادیو اکتیو ندارند و برای سلامتی خطرزا نیستند. همچنین به دلیل بالا بودن نیمه عمرشان، پایداری شیمیایی مناسبی از خود نشان میدهند.

تحریک این ذرات با نور مرئی و سایر ویژگی های مثبتی که برای آن ذکر شد، آنها را به گزینهای مناسب برای استفاده در داربست شبکیه چشم تبدیل کرد. در این مطالعه، خواص اپتیکی، مکانیکی و مورفولوژی این سه دسته از داربست ها با توزیع متفاوت نانوذرات مورد بررسی قرار گرفتند و در نهایت تاثیری که بر روی تکثیر و تمایز سلول های شبکیه میگذارند، مشخص شد.


نکته ای که در ابتدای امر به آن توجه شد این بود که آیا پوشش دهی نانوذرات در طول موج بازتابی از آنها اثرگذار است یا خیر. نتیجه بررسی ها نشان داد که طول موج تحریک این ذرات قبل و پس از پگیلاسیون تغییری نکرده است و هر دو در اثر انرژی حاصل از طول موج nm 390 تحریک میشوند اما طول موج بازتابی از آنها تغییر میکند بدین صورت قبل از پوشش دهی، nm 520 و بعد از nm 560 بوده است.

چون هنوز هم این طول موج بازتابی در محدوده طیف مرئی امواج الکترومغناطیس قرار دارد پس مشکلی برای آزمایشها به وجود نمیآورد. کاهش شدت در طول موج بازتابی را میتوان به دلیل اثرات پوشش دهی در نظر گرفت اما بازهم میزان قابل قبولی از شدت را داراست.

بررسی اثر سیگنال مکانیکی
در پژوهشی اثر مدول الاستیک ماتریس بر روی سلول های اپیتلیال رنگدانهدار مورد بررسی قرار گرفته است. پیوند سلولهای اپیتلیال رنگدانهدار برای درمان بیماری های دژنراسیون شبکیه با چالش هایی روبه رو است. دو چالش اصلی این پیوند سلولی، تمایز و پاسخ های التهابی است که در پی پیوند در شبکیه با خود به همراه میآورد.

تاکنون اثر سفتی داربست بر روی رفتارهای سلول های شبکیه مورد بررسی قرار نگرفته است که حال در این پژوهش هدف بر مشخص کردن تأثیر آنها روی رفتارهای رده سلولی خاصی از شبکیه (سلول های اپیتلیال رنگدانهدار) است.

سلول های اپیتلیال رنگدانه دار از یک سمت به غشای براچ که غشای پایه شبکیه است متصل هستند و ویژگی های مکانیکی خاصی دارند تا سدی در برابر مویرگ های کروئیدی ایجاد کنند و فقط امکان نقل و انتقال مواد غذایی و زاید و اکسیژن را به داخل شبکیه بدهند.

با افزایش سن خواص مکانیکی این غشا دچار تغییراتی میشود که در نهایت روی میزان چسبندگی سلول های اپیتلیال رنگدانه دار اثر میگذارد و سبب جدا شدن و مرگ آنها میشود. در نتیجه میتوان متوجه شد که توجه به مدول یانگ میتواند رفتارهای این دسته از سلولها را کنترل کند.


در این پژوهش از پلیمر پلیاتیلن گلایکول دیآکریلات (PEGDA) که امکان دستکاری و تغییر خواص مکانیکی و مدول الاستیک را با تغییر در وزن مولکولی داراست و همچنین زیست خنثی است، استفاده شده است. وزن مولکولی از kDa 3.43 تا kDa 20 تغییر کرده است و به تبع آن مدول الاستیک از kPa 60تا kPa 1200 متغیر است.


به دلیل زیست خنثی بودن این پلیمر و برای این که سلول ها بتوانند چسبندگی روی سطح داربست پلیمری داشته باشند، سکانس پپتیدی RGDS روی سطح نشانده شده است و رده سلولی اپیتلیال رنگدانه دار انسانی برای کشت در هیدروژل مورد استفاده قرار گرفته است. چسبندگی سلول ها، فعالیت متابولیکی و بین ژن آنها در داربست ها با سفتی های گوناگون، متفاوت گزارش شد.


یکی از چالش ها بحث پاسخ های التهابی بود که پس از پیوند سلول ها ایجاد میشد. بیان پروتئینهای IL-6 و MCP-1 و حضور آنها در محیط کشت سلولی که سبب مهاجرت سلول های میکروگلیال به شبکیه میشوند، نشان دهنده بروز پاسخ های التهابی است.

در بررسیها مشخص شد که با افزایش سفتی داربست، میزان بیان این پروتئین ها نیز افزایش مییابد و برعکس؛ هرچه مدول الاستیک کمتر باشد، بیان این مارکرهای التهابی نیز کمتر خواهد بود.


پس یکی از اثراتی که سفتی داربست و دستکاری خواص مکانیکی میتواند بر روی موفقیت آمیز بودن یا نبودن مهندسی بافت شبکیه داشته باشد، امکان کاهش پاسخ های التهابی در محیط با کاهش بیان پروتئینهای جذبکننده سلوله ای ایمنی سیستم عصبی (میکروگلیا) است و در این حالت از ایجاد اسکار میکروگلیایی روی داربست جلوگیری میشود و بافت میتواند عملکردی مناسبتری داشته باشد.

چالش دیگری که با آن روبه رو هستیم، توانایی سلول های اپیتلیال رنگدانه دار در تمایز یا تمایز انتقالی (Transdifferentiate) به ماکروفاژها یا سلولهای مشابه فیبروبلاست (Fibroblast-like) است. باید جلوی اینگونه از تمایزها گرفته شود چون به جای سلول های مدنظرمان سلول های دیگری داریم که از عملکردی بودن بافت حاصل کم میکند.

مدول الاستیک داربست میتواند بر روی رفتارهای چسبندگی، مهاجرت، بیان ژن و تمایز و عملکرد سلول های مختلف نقش داشته باشد. سلول های اپیتلیال رنگدانهدار جزو سلول هایی هستند که انجام مابقی عملکردهایش وابسته به چسبندگی اولیهاش به سطح است و اگر این اتصال صورت نگیرد مرگ سلولی را به همراه خواهد داشت.

با مقایسه بین سلول هایی که روی ژل سخت قرار دارند در مقابل سلول هایی که روی سوبسترای نرمتر هستند، متوجه میشویم که هرچهه سوبسترا نرمتر باشد میزان پهن شوندگی سلولی کاهش مییابد، آهنگ جنبش های سلولی افزایش می یابد و چسبندگی سلولها به صورت دینامیک و پویاست.

 چسبندگی سلولها به صورت دینامیک و پویا

باتوجه به شکل های بالا اثر مدول الاستیک را بر روی میزان چسبندگی سلولی مشاهده میکنیم. نمونه A نمونه کنترل (Tissue Culture Plastic) است و B و C به ترتیب داربست با مدول یانگ بالا و پایین را نشان میدهد.

همان طور که در تصاویر مشاهده میشود پهن شوندگی و چسبندگی همگنی بر روی داربست با مدول بالا وجود دارد در حالی بر روی داربست با مدول کمتر، کلاسترهایی با درصد بالای سلول های مرده تشکیل شده است که نشان دهنده چسبندگی بد سلول ها است و چون سلول های اپیتلیال رنگدانهدار وابسته به لنگراندازی و چسبندگی هستند پس دچار مرگ سلولی شده اند.


حال به بررسی رفتار تمایزی سلول ها در برابر میزان سفتی داربست میپردازیم. بیان ژن و تمایز سلولی را میتوان در سه دسته جای داد.
۱ – بیان ژن هایی که منجر به پاسخ های التهابی میشوند. (IL-6, IL-8, MCP-1)
2- بیان ژن هایی که تمایز سلولی را به همراه دارند. (SMAD3)
3- بیان ژن هایی که سبب عملکرد خاصی میشوند. (CRALBP)


بیان ژنهایی که پاسخ های التهابی را به همراه دارند برای هر سه آنها چه در داربست با مدول کم یا زیاد بیشتر از نمونه کنترل است بجز در مورد فاکتور IL-8 که در داربست با مدول یانگ کمتر، بیان این پروتئین کمتر از نمونه کنترل است. در همه موارد هم داربست با مدول بیشتر، بیان این ژنها افزایش بیشتری داشته است و پاسخ های التهابی را بیشتر به همراه دارد.


ژن های عملکردی در هر دو دسته از داربست ها بیان کمتر نسبت به نمونه کنترل دارند اما بیان ژنهای تمایزی در هر دو نمونه تقریباً به یک میزان نسبت به نمونه کنترل افزایش داشته است. پس مدول یانگ سطح بیشترین نقش را در بیان ژنهایی که مسبب پاسخ های ایمنی هستند ایفا میکند.

میزان چسبندگی و فعالیت های متابولیکی و زنده مانی سلولها با افزایش مدول یانگ سطح، بیشتر شد اما به تبع آن پاسخ های التهابی نیز افزایش یافتند. در نتیجه باید مقدار بهینه ای را برای افزایش مدول یانگ پیدا کرد تا بتوان اثر واکنش های التهابی را نیز کاهش داد.

منابع مقاله

[۱] A.P. Duarte,M.H.Gil. “Surgical adhesives:Systemic review of
[1]A. L. Mescher, Junqueiras’s Basic Histology Text and Atlas. 2013.
[2]C. E. Willoughby, D. Ponzin, S. Ferrari, A. Lobo, K. Landau, and Y. Omidi, “Anatomy and physiology of the human eye: Effects of mucopolysaccharidoses disease on structure and function – a review,” Clin. Exp. Ophthalmol., vol. 38, no. SUPPL. 1, pp. 2–۱۱, ۲۰۱۰٫
[۳]M. Castro, S. Johansson, F. Johansson, and U. Englund, “Molecular and Cellular Neuroscience Exploration of physical and chemical cues on retinal cell fate,” Mol. Cell. Neurosci., vol. 75, pp. 122–۱۳۲, ۲۰۱۶٫
[۴]A. Sepahvandi, “investigation on photoluminescence properties of SrAl2O4: Eu2+, Dy3+/CS-PCL composite scaffolds on cell behavior in retina tissue engineering,” ۲۰۱۶٫
[۵]M. Yamashita, “Weak electric fields serve as guidance cues that direct retinal ganglion cell axons in vitro,” Biochem. Biophys. Reports, vol. 4, pp. 83–۸۸, ۲۰۱۵٫
[۶]R. White, Corina; Rutgers, DiStefano, Tyler, Olabisi, “The influence of substrate modulus on retinal pigment epithelial cells,” Biomed. Mater. Res., pp. 1–۴۴, ۲۰۱۶٫

برچسب ها
نمایش بیشتر

نوشته های مشابه

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *

دکمه بازگشت به بالا
بستن
بستن

adblock را غیر فعال کنید

سیستم زوم طب روشی را برای دور زدن تبلیغات در سیستم شما یافته است جهت حمایت از ما از استفاده از آن صرف نطر کنید